Un team di ricercatori italiani ha compiuto un importante passo avanti nella medicina fetale, sviluppando e testando una nuova tecnica per la somministrazione di terapia genica direttamente nel feto attraverso una procedura minimamente invasiva e guidata dall’ecografia. Lo studio è stato realizzato mediante l’utilizzo di suini come modello animale ed è il frutto di una collaborazione tra l’Istituto Neurologico Carlo Besta, l’Ospedale Policlinico di Milano e il laboratorio Avantea di Cremona. I risultati sono stati pubblicati a luglio sulla rivista internazionale Gene Therapy.

Tra i principali autori figurano Dario Brunetti, della Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, della Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta, e docente di Scienze Tecniche Mediche e Chirurgiche Avanzate presso l’Università degli Studi di Milano, e Nicola Persico, della Prenatal Diagnosis and Fetal Surgery Unit, Fondazione IRCCS Ca’ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, professore associato di Ostetricia e Ginecologia all’Università degli Studi di Milano.

L’intervento sul feto di maiali sani per valutare la fattibilità della procedura e gli effetti a breve termine

Come spiegano i due ricercatori, l’intervento di terapia genica non è ancora stato effettuato per una malattia specifica, ma è stato testato su suini sani (più simili all’uomo rispetto ad altri modelli per dimensioni, anatomia, fisiologia, sviluppo fetale e risposta immunitaria), utilizzando un vettore virale (AAV9) che trasportava un gene «reporter» (GFP). Questo ha permesso di valutare la sicurezza, la distribuzione del vettore e la fattibilità della procedura.

«Il modello sviluppato dimostra che la procedura è fattibile, ben tollerata e permette la distribuzione del gene esogeno in diversi organi, aprendo la strada a future applicazioni cliniche per malattie congenite» racconta Brunetti.

Il vantaggio della terapia genica in utero: evitare che si manifestino i primissimi danni

Lo scopo finale dello studio è applicare questa tecnica a malattie genetiche gravi ad esordio fetale, «che iniziano a danneggiare i tessuti già durante la gravidanza. Un trattamento precoce in fase prenatale eviterebbe l’istaurarsi di danni irreversibili migliorando o mitigando gli esiti clinici postnatali» sottolinea Nicola Persico; «intervenire dopo la nascita spesso non basta a prevenire queste lesioni».

Oltre a permettere di correggere la malattia prima che i tessuti vengano danneggiati, la terapia in utero «sfrutta le dimensioni ridotte del feto; pertanto, si possono utilizzare dosi minori di terapia» sostiene Brunetti.

«Inoltre» aggiunge, «consente di raggiungere meglio il cervello, perché la barriera emato-encefalica è ancora immatura. E il sistema immunitario del feto, essendo immaturo, è più tollerante nei confronti della terapia e meno propenso a sviluppare una forte risposta immunitaria contro il vettore virale e la proteina terapeutica introdotta».

Il rischio di reazioni avverse viene ridotto e, soprattutto, potrebbe essere possibile fare ulteriori somministrazioni dopo la nascita: «nelle terapie geniche somministrate dopo la nascita l’organismo sviluppa spesso una risposta immunitaria contro il vettore o la proteina esogena già alla prima somministrazione, rendendo difficile o impossibile ripetere il trattamento».

L’approccio prenatale potrebbe pertanto superare questo importante limite delle terapie postnatali, oltre ad essere potenzialmente più efficace e duraturo per alcune malattie congenite.

La procedura: minimamente invasiva, simile a quelle già utilizzate in medicina fetale

«Abbiamo scelto una procedura minimamente invasiva in modo da poter poi esser facilmente traslabile sugli umani» ricorda Dario Brunetti.

La procedura sfrutta tecniche già consolidate in medicina fetale, come la trasfusione intrauterina, che offre un buon profilo di sicurezza, adattate per la somministrazione di terapia genica.

«La terapia viene somministrata attraverso una iniezione transaddominale sotto guida ecografica; abbiamo utilizzato un ecografo ad alta risoluzione per individuare la posizione del feto e i suoi vasi sanguigni principali (come la vena ombelicale) o la cavità cardiaca. Attraverso la parete addominale e uterina della madre, un sottile ago sterile viene inserito nel feto, sempre sotto controllo ecografico in tempo reale, per garantire precisione e sicurezza. La soluzione contenente il vettore virale viene quindi iniettata direttamente nel sistema circolatorio fetale».

E i tempi chirurgici sono stati mantenuti brevi per ridurre lo stress da anestesia e il rischio di parto pretermine.

Sotto il profilo della sicurezza, i risultati hanno soddisfatto i ricercatori: «il monitoraggio post-procedura non ha evidenziato complicanze, tossicità né danni ai tessuti, dimostrando che la somministrazione può essere effettuata in modo sicuro e controllato» afferma Brunetti.

Il secondo passaggio: validare l’efficacia su un modello portatore di patologia

Grazie alle moderne tecniche di ingegneria genetica, i ricercatori hanno generato modelli suino di malattie genetiche umane.
E un modello suino con una mutazione nel gene SURF1 che causa la Sindrome di Leigh, una rara malattia mitocondriale che colpisce i bambini neonati e che è ancora incurabile, è ora utilizzato per validare l’efficacia terapeutica della procedura.
In questo passaggio si inserisce una copia funzionale del gene mancante, tramite un vettore AAV9 (adeno-associated virus sierotipo 9), per curare la malattia prima ancora che si manifestino i primi danni irreversibili.

Il vettore AAV9: come funziona e perché è considerato sicuro

Spiega Brunetti: «l’AAV9 entra nelle cellule bersaglio e rilascia il suo DNA, che rimane principalmente episomale, cioè non si integra nel genoma della cellula evitando quindi il rischio di effetti off-target. Il gene trasportato viene quindi espresso dalla cellula per produrre la proteina terapeutica desiderata. AAV9 ha una naturale capacità di infettare sia cellule in divisione sia cellule mature, come quelle muscolari e nervose, e attraversa la barriera emato-encefalica più facilmente di altri sierotipi, rendendolo utile per malattie multisistemiche o neurologiche».

I ricercatori spiegano che non è patogeno per l’uomo e non causa malattia, perché deriva da un virus naturalmente innocuo: «ha dimostrato un buon profilo di tollerabilità in molti studi preclinici e clinici, con effetti collaterali generalmente lievi o assenti alle dosi corrette. Inoltre, è già approvato per diverse terapie geniche cliniche (come per l’atrofia muscolare spinale e la distrofia retinica), il che conferma la sua affidabilità e il suo utilizzo consolidato».

Nello studio pubblicato, gli autori riportano che la terapia genica somministrata con il vettore AAV9 ha raggiunto con successo gli organi target, mostrando una buona distribuzione sistemica con «una espressione robusta del gene nei tessuti periferici, soprattutto nel fegato e nel cuore, e dei livelli più bassi ma comunque rilevabili in muscolo scheletrico, polmoni, rene e cervello».Nessun segno di tossicità, infiammazione o risposta immunitaria significativa nei feti o nelle madri.

«L’analisi dei marker immunitari ha mostrato solo un lieve aumento di alcune citochine infiammatorie (GM-CSF, GRO-α, IFN-γ) senza alterazioni istologiche o cliniche, e non è stata rilevata la presenza di anticorpi anti-AAV9 né nei feti né nelle madri» sostiene Brunetti.

I dati di follow-up a breve termine: nessun evento avverso grave

«Abbiamo seguito i maialini nati fino a un mese di età e i neonati positivi per il transgene sono cresciuti regolarmente, senza segni di sofferenza, infezioni o disturbi comportamentali. L’espressione del transgene era ancora rilevabile in fegato e cuore dopo un mese, anche se attenuata, come atteso per un vettore episomale in animali in rapida crescita» raccontano i ricercatori.

Prima della sperimentazione sull’uomo necessari ancora diversi passaggi

Studi più lunghi sul modello malattia saranno necessari per valutare la durata terapeutica dell’effetto e la sicurezza a lungo termine. Oltre a testare la procedura in modelli animali malati geneticamente modificati, sarà infatti necessario raccogliere dati sul follow-up a lungo termine, per valutare la durata dell’espressione del gene, la crescita e lo sviluppo degli animali e l’assenza di effetti avversi tardivi.

«Il sistema è potenzialmente adattabile a tantissime malattie genetiche – afferma Nicola Persico – Per ogni caso specifico si dovranno valutare i dosaggi ottimali, il timing e la modalità di somministrazione per migliorare la distribuzione nell’organo bersaglio e massimizzare il beneficio».

Prima di passare all’uomo si dovrà discutere con le autorità regolatorie un piano per la traduzione clinica, «che includa studi di fase 1/2 in piccoli gruppi di pazienti con malattie gravi, per cui non esistono terapie efficaci».